training_class

1) workflow

2) 背景介绍

(1) Ribo-seq原理

Ribo-seq是2009年Weissman课题组首次发表的研究细胞内蛋白翻译图谱的新型二代测序技术，用来描述全基因组水平蛋白质的翻译情况。主要是选择性捕捉80S核糖体及其结合的RNA片段而定位核糖体所位于的RNA的位置。

具体步骤为：

• 在细胞裂解物中富集多聚核糖体（polysome）；
• 将多聚核糖体用核酸酶（RNA nuclease）消化成单核糖体（monosome）
• 选择性的收集和富集80S核糖体并经纯化得到80S核糖体所保护的RNA片段。
• 在此过程中，将80S核糖体保护的RNA片段进行下一步构建文库和测序（图1）。
• 最后，通过生物信息学的分析获得细胞当前状态下的翻译图谱 。

Ribo-seq数据测得的RNA片段长短与small RNA-seq相似，大约分布在25~35nt区间。由于Ribo-seq是特异性描述细胞的翻译组，因此其数据的测序片段大多比对到基因组的CDS区域（coding region）。此外，Ribo-seq还有一个明显区别于其他RNA-seq的特点，即Ribo-seq的序列在CDS区域往往呈现3-nt的周期性（图1）。这主要依赖于翻译过程中核糖体通常以3-nt的周期进行移动。

图1

(2) 环境准备

2.1

download scripts from https://github.com/lulab/Ribowave

2.2 Requirements

2.2.1 software:

R, bedtools v2.25.0

2.2.2 R packages:

reshape, ggplot2, rhdf5, methods, wmtsa, parallel

(3) Pre-processing

启动ribo-seq所用的docker（按照链接所示加载新的环境）

启动新的docker环境

docker load -i ~/Desktop/bioinfo_tsinghua_6.2_apa_6.3_ribo_6.4_structure.tar.gz
docker run —name=rnaregulation -dt -h bioinfo_docker —restart unless-stopped -v ~/Desktop/bioinfo_tsinghua_share:/home/test/share gangxu/bioinfo_tsinghua_6.2_apa_6.3_ribo_6.4_structure:latest
docker exec -it rnaregulation bash

进入工作目录

cd /home/test/rna_regulation
cd /home/test/rna_regulation/ribo-wave

3) running steps

(1) create annotation

# bedtools2没有添加到环境变量中，需要临时添加
export PATH=$PATH:test@bioinfo_docker:~/software/bedtools2/bin
# 运行annotation脚本（这一步时间会很久，生成文件已经提前跑好放在了annotation_fly目录下，可以跳过直接进行下一步）
script/create_annotation.sh \
-G annotation_fly/dmel-all-r6.18.gtf \
-f annotation_fly/dmel-all-chromosome-r6.18.fasta  \
-o annotation_fly  \
-s script

input files

1. : the annotation gtf should contain start_codon and stop_codon information,eg: dmel-all-r6.18.gtf
2. : genome fasta ,eg: dmel-all-chromosome-r6.18.fasta
3. : the directory for all the annotation output
4. : the directory of all the scripts in the package

output files

annotation directory, including :

1. start_codon.bed : the bed file annotating start codon
2. final.ORFs : all identified ORFs, eg: FBtr0300105_0_31_546 where FBtr0300105 refers to the transcript, 0 refers to the reading frame relative to the start of transcript, 31 refers to the start site, 546 refers to the stop codon.

(2) P-site determination

核糖体上具有一系列与蛋白质合成有关的结合位点与催化位点，分别为A位点(aminoacyl-site，A-site)，P位点(peptidyl-site，P-site)和E位点(exit-site，E- site)先后与tRNA发生结合。P位点是肽段翻译延长的主要场所，在该位点上tRNA将携带的氨基酸移交给旁边的肽段从而使得肽段序列发生延长。为了能够更加明显的观察到3-nt的周期性，在处理Ribo-seq数据时我们参考之前已发表的方法，对每一条Ribo-seq比对上的测序片段转换为其对应的P-site位点。

This step determines the P-site position for each Ribo-seq reads length by overlapping with the annotated start codons from previous step

# 运行P-site_determination.sh脚本
script/P-site_determination.sh \
-i GSE52799/SRR1039770.sort.bam \
-S annotation_fly/start_codon.bed \
-o GSE52799 \
-n SRR1039770 \
-s script;

input files

1. : secondary alignment removed to ensure one genomic position per aligned read and sorted
2. annotation :